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Western Blot

Guidebook

蛋白免疫印跡實驗指南

Western Blot(WB)蛋白印跡實驗是一種廣泛用于分子生物學的技術(shù),用于檢測和分析特定蛋白質(zhì)。該技術(shù)通過電泳分離蛋白質(zhì),然后將其轉(zhuǎn)移到膜上,并利用抗體進行特異性檢測。 為了幫助初學者快速上手并成功實施WB實驗,我們?yōu)榇蠹覝蕚淞说鞍酌庖哂∮泴嶒炛改?,其中包括?/h1>

1.WesternBlot 實驗操作指南

2.Western Blot實驗進階

3.Western Blot疑難排查

1.樣本制備

使用機械或化學方法提取生物樣本中的蛋白質(zhì), 定量總蛋白,樣品與緩沖液混合,然后裝在凝膠上進行電泳。

 

注意事項:

> 蛋白質(zhì)在樣品處理過程應在低溫下進行,以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾(加入合適的蛋白酶抑制劑)。

> 樣品建議分裝成合適的量(比如分裝出 20μL 檢測蛋白質(zhì)定量用),然后 -20°或 -80℃中長期保存,注意不要反復凍融,因為會使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。

> 切莫使用不新鮮的上樣緩沖液,同時在處理時應注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。

2.SDS PAGE 電泳

蛋白樣品被裝載到凝膠上,通過電泳將它們按大小分開。

 

注意事項:

 

> 配膠試劑里面的 AP 需要根據(jù)實驗室實際溫度來適量的增加或者減少,比如夏天溫度較高, 自然凝膠速度較快,AP 的量需要適當?shù)臏p少;冬天溫度低,凝膠慢,需要適量的增加。

 

> 灌膠時掌握好速度,避免氣泡產(chǎn)生(注意濃度越小的膠含水越多,凝固后膠體積縮小越多)。加水液封時速度要很慢,否則膠會被沖變形。

 

> 所有的蛋白樣品定量一致,體積一致,不夠的用裂解液補足,樣品兩側(cè)的泳道用等體積 的1×Loading Buffer 上樣,Marker也用1×Loading Buffer調(diào)制與樣品等體積,這樣可以避免出現(xiàn)誤差。

 

> 加樣前可用 5mL 注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。加入下一個樣品前,進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次,以免交叉污染。上樣時,小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。

 

> 電泳時間和電壓說法各異。一般電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴散,上樣后應盡快進行電泳,電泳結(jié)束后也應直接或者轉(zhuǎn)印。

所需產(chǎn)品:

XinPRO迷你垂直電泳槽

3.蛋白轉(zhuǎn)膜

將蛋白從凝膠基質(zhì)移動到合成膜支持物上,并與膜相結(jié)合,形成印跡。

 

注意事項:

> 選擇合適的膜和緩沖液是確保蛋白轉(zhuǎn)印成功的關(guān)鍵。必須通盤考慮蛋白質(zhì)的大小和電荷、轉(zhuǎn)印方法和膜 的結(jié)合特性。

> 切濾紙和膜時一定要戴干凈手套,因為手上的蛋白會污染膜。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1min~2min。

> 在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF 膜和濾紙,平衡 10min左右,也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的 SDS。

> 用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動,除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡,因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。

> 用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干。這一步很重要,寧可太干也不能太濕,太干容易燒胡,太濕的話多余的緩沖液會導致電流短路,大大降低轉(zhuǎn)移效率,如果同時轉(zhuǎn)好幾條膠的時候更要小心,有一個膠短路就會影響整體的轉(zhuǎn)移效率。

所需產(chǎn)品:

XinBLOT 迷你轉(zhuǎn)印槽

4.封閉

對轉(zhuǎn)印后的膜進行封閉,阻斷膜上未結(jié)合位點,以防止與抗體的非特異性結(jié)合。

 

注意事項:

> 做磷酸化蛋白的western時使用BSA(牛血清蛋白)作為封閉液。奶粉含有酪蛋白(一種磷酸化蛋白),如果用奶粉,有可能出現(xiàn)背景深的現(xiàn)象。并且脫脂奶粉含磷酸酶,磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化,用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時會受到影響。

5.抗體孵育

膜首先與一種特異性針對目標蛋白上一個抗原表位的初級抗體孵育。經(jīng)過幾次洗滌后,隨后會與一個標記的二級抗體孵育,以提供檢測的手段。

 

注意事項:

> 為減少非特異結(jié)合,可選用封閉液作為一抗和二抗的抗體稀釋液。

> 一抗孵育條件推薦 4°C過夜, 二抗孵育條件為室溫,1h。

> 洗滌液推薦選用 TBST 緩沖液。洗滌時應保持適中的搖床速度,避免過快導致膜上的蛋白 或抗體脫落,同時確保洗滌液能夠充分接觸到膜上的每一個角落。在洗滌過程中,適時更換 新的洗滌液以確保洗滌效果。

> 洗滌過程中需要保持膜的濕潤,避免膜干燥導致抗體結(jié)合力下降或蛋白變性。

6.發(fā)光顯影

將膜清洗以移除未結(jié)合的抗體后,使用二抗上的標簽來可視化感興趣的蛋白。抗體可以標記有產(chǎn)生顏色和光的酶,或者直接用熒光標記來可視化蛋白。

 

注意事項: 

> 采用暗室膠片曝光方法,操作需要盡量熟練,除了要把握曝光時間,還要避免位移(壓片、取片過程中膠片和雜交膜不能有移動);保留好膠片,作為原始憑證;

> 使用化學發(fā)光成像儀采集圖像,注意采集白光下的圖像,并與發(fā)光的圖像進行融合,作為原始憑證保存。

相關(guān)產(chǎn)品

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ChemiScope S7-

ChemiScope S7

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ChemiScope 6000系列-

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ChemiScope 6000 是一款高性能化學發(fā)光和熒光成像系統(tǒng),可根據(jù)您的需要進行升級,實現(xiàn)完全的應用靈活性。

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*感興趣的產(chǎn)品
感興趣的產(chǎn)品
  • 凝膠成像系統(tǒng)
  • 化學發(fā)光成像系統(tǒng)
  • 小動物活體成像系統(tǒng)
  • 植物活體成像系統(tǒng)
  • 電泳儀
  • 其他
實驗目的/方向
*聯(lián)系人
*聯(lián)系方式
單位
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